研究内容1

研究の内容

１．レトロトランスポゾン（ＬＩＮＥ）の転移機構の解明と応用

（研究の背景）

2003年にヒトゲノムの解読がほぼ終了し、研究者の多くはゲノムの50％をも占める利的遺伝子（selfish genes）の膨大さにあらためて驚かされました。特に、LINE（long interspersed nuclear element）と呼ばれる転移因子は、その半数以上を占め、現在も活発に転移を繰り返し、ある種の遺伝病やガンの原因となっているといわれます。LINEは正式にはnon-LTR型レトロトランスポゾンと呼び、エイズウィルスなどのレトロウィルスやそれに近いLTR型レトロトランスポゾンよりも進化的に古いと考えられます（図１参照）。逆転写によってゲノムに入り込む転移因子を総称してレトロ因子と呼びますが、レトロウィルスに近いLTR型の研究が進む一方で、LINEについては、いまだにその転移方法すら明確にされていません。　レトロ因子は、遺伝子導入で頻繁に利用され、機能解明の進んでいるDNA型のトランスポゾン（ショウジョウバエのｐ因子など）とは起源を全く異とするものです。

LINEは、ヒトゲノムに限らずほぼ全ての真核細胞に存在し、生物種（ヒトやカイコ）によってはゲノムの10％以上を占め、ゲノム進化を語る上で欠かせないものです。転移にあたって、変異・欠失・逆位などを引き起こす一方、プロモーターやエンハンサー、特定の機能ドメイン領域の持ち込み、processed pseudogeneの形成など、遺伝子の機能進化にも重要な働きを果たしてきました。LINEは単なる厄介者ではなく、ゲノム再構築に大きな役割を果たしてきた功労者であるともいえます。しかし、LINEの転移メカニズムの知識の不足が研究の妨げとなっています。私たちの研究の目標の一つは、昆虫にユニークないくつかのLINEを用いて、LINEの転移メカニズムを完全に解明することです。

テロメラーゼの活性が極めて低いレベルに抑えられているカイコ（項目２を参照ください）では、テロメア反復配列を標的にしたSART, TRASという特殊なnon-LTR型レトロトランスポゾンが活発に転移しています。私たちはこのテロメア領域に特異的に挿入するレトロポゾンやｒＤＮＡにのみ転移するレトロトランスポゾン（R1, R2）を利用して、LINEの転移メカニズムを完全に解明したいと考えています。そのための手法として、核多角体ウィルス(AcNPV)にこれらのレトロトランスポゾンを組み込み、感染によりゲノム内の特定の場所に転移させ、PCR法により効率的に転移を検出する方法を開発しました。（下図参照）（参考文献）Okazaki et al. (1995, 1997), Takahashi & Fujiwara (2002), Kawashima et al. (2007), Osanai-Futahashi & Fujiwara (2011).

　この方法を用いると、LINEのどのような領域に転移に必須な機能が隠されているのかを比較的容易に調べることができます。現在、このような機能が比較的解析されているのはヒトのL１というレトロトランスポゾンですが、私たちの実験系では、これまで知られていない数々のLINEの機能領域を明らかにしてきました。下の図は、当研究室が明確にした、テロメア特異的LINEのSART1の構造と機能領域の概略を示しています。

（現在行っている研究の概略）

（Ａ）　LINEのORF1タンパク質の機能と適応戦略：　多くのLINEは二つのORF (Open reading frame)から構成されていますが、ORF2が逆転写酵素など転移に必須な機能ドメインを持っているのに対し、ORF1の機能はほとんど知られていません。SART1のORF1の機能ドメインを網羅的に調べた結果、ORF1の中には、新規な核移行シグナル、テロメアに結合する領域、タンパク質相互作用に関わっている領域などが明らかになりました。このような機能は、ホストの遺伝子への影響を最小限に留めてテロメアだけに転移してコピーを拡大する、という適応戦略を可能にしていると考えられます。様々なLINEのORF1が個々のライフサイクルにあった適応的機能を付加しているとすれば興味深いことです。（参考文献）Matsumoto T. et al. (2004), Matsumoto T. et al. (2006), Osanai-Futahashi & Fujiwara (2011).

（Ｂ）LINEの逆転写機構の解明：　LINEは、レトロウィルスに近縁なLTR型レトロトランスポゾンが細胞質で逆転写を起こし転移するのとは異なり、核のDNAを直接標的として切断し、そこで逆転写を起こして転移します。このメカニズムをTPRT（target primed reverse transcription）と呼び、テロメラーゼなども似たメカニズムを持っています。しかし、TPRTがどのようなプロセスで始まり、進行するのかはまだよくわかっていません。どのようなタンパク質-ＲＮＡ複合体が転移ユニットを形成し、核や標的ＤＮＡへどのようにアクセスするのか？ＤＮＡの切断はどのようにして起こり、逆転写はどのように始まり進行するのか？などの疑問があります。タンパク質－RNA－DNA間の複雑な相互作用が予想されますが、その解明はレトロ因子の動態・進化やゲノム再構築などの理解に大きなインパクトを与えると期待しています。（参考文献）Osanai et al. (2004), Anzai et al. (2005), Osanai-Futahashi & Fujiwara (2011), Nichuguti et al. (2016).

（C）遺伝子導入ベクターとしてのLINEの利用：利己的遺伝子の多くはトランスジェニック個体の作成のためのベクターとして広く使われてきました。しかし、LINEはその転移メカニズムが不明であるため、これまでほとんど使われることはありませんでした。私たちは核多角体ウィルスによりテロメア特異的LINEを昆虫細胞内で発現させ、テロメア領域に転移させることに成功しました。LINEはほとんどすべての真核細胞に存在するので、同様の方法が利用できるのではないかと考え、他の昆虫や魚類など広範な生物にLINEを用いて遺伝子を効率的に導入する手法を研究しています。また、部位特異的LINEを用いると宿主の遺伝子を破壊することなく外来遺伝子を安全に導入することができるようになります。これは特にヒトの遺伝子治療などで危惧されている問題を回避することに役立ちます。私たちはヒト細胞を用いてゲノムの特定領域に入る遺伝子導入ベクターの開発を行っています。（参考文献）Takahashi & Fujiwara (2002), Kawashima et al. (2007), Fujiwara (2015).

（参考文献・総説一覧）　上記研究に特に関係の深いものは黄色で示した

1) Fujiwara, H., Ogura, T., Takada, N., Miyajima, N., Ishikawa, H. and Maekawa, H.: Introns and their flanking sequences of Bombyx mori rDNA. Nucleic Acids Res. (1984) 12, 6861-6869.

2) Fujiwara, H., Ninaki, O., Kobayashi, M., Kusuda, J. and Maekawa, H.: Chromosomal fragment responsible for genetic mosaicism in larval body marking of the silkworm, Bombyx mori. Genet. Res. (1991) 57, 11-16.

3) Okazaki, S., Tsuchida, K., Maekawa, H., Ishikawa, H. and Fujiwara, H.: Identification of a pentanucleotide telomeric sequence, (TTAGG)n, in the silkworm, Bombyx mori and in other insects. Mol. Cell. Biol. (1993) 13, 1424-1432.

4) Fujiwara, H., Yanagawa, M. and Ishikawa, H.: Mosaic formation by developmental loss of chromosomal fragment in a genetic mosaic, mottled striped of the silkworm, Bombyx mori. Roux's Arch. Dev. Biol. (1994) 203, 389-396.

5) Fujiwara, H. and Maekawa, H.: RFLP analysis of chromosomal fragments in mottled striped strains of the silkworm, Bombyx mori. Chromosoma (1994) 103, 468-474.

6) Okazaki, S., Ishikawa, H. and Fujiwara, H: Structural analysis of TRAS1, a novel family of telomeric repeat associated retrotransposons in the silkworm, Bombyx mori. Mol. Cell. Biol. (1995) 15, 4545-4552.

7) Takahashi, H., Okazaki, S. and Fujiwara, H.: A new family of site-specific retrotransposons, SART1, is inserted into telomeric repeats of the silkworm, Bombyx mori.. Nucleic Acids Res. (1997) 25, 1578-1584.

8) Takahashi, H. and Fujiwara, H.: Transcription analysis of the telomeric repeat-specific retrotransposons TRAS1 and SART1 of the silkworm Bombyx mori. Nucleic Acids Res. (1999) 27, 2015-2021.

9) Sasaki, T. and Fujiwara, H.: Detection and distribution patterns of telomerase activity in insects. Eur. J. Biochem. (2000) 267, 3025-3031.

10) Fujiwara, H., Nakazato, Y., Okazaki, S. and Ninaki, O.: Stability and telomere structure of chromosomal fragments in two different mosaic strains of the silkworm, Bombyx mori. Zool Sci. (2000) 17, 743-750.

11) Anzai, T., Takahashi, H. and Fujiwara, H.: Sequence-specific recognition and cleavage of telomeric repeat (TTAGG)n by endonuclease of non-LTR retrotransposon, TRAS1. Mol Cell. Biol. (2001) 21, 100-108.

12) Kubo, Y., Okazaki, S., Anzai, T. and Fujiwara, H.: Structural and phylogenetic analysis of TRAS, telomeric repeat-specific non-LTR retrotransposon families in lepidopteran insects. Mol. Biol. Evol, (2001) 18. 848-857.

13) Kojima, K, Kubo, Y. and Fujiwara, H.: Complex and tandem repeat structure in sub-telomere of crickets, T. taiwanemma. J. Mol. Evol, (2002) 54, 474-485.

14) Takahashi, H. and Fujiwara, H.: Transplantation of target site specificity by swapping endonuclease domains of two LINEs. EMBO. J. (2002) 21, 408-417.

15) Kojima, K. K. and Fujiwara, H.: Evolution of target specificity in R1 clade non-LTR retrotransposons. Mol. Biol. Evol, (2003) 20, 351-361.

16) Kojima, K. K. and Fujiwara, H.: Cross-genome screening of novel sequence-specific non-LTR retrotransposons: various multicopy RNA genes and microsatellites are selected as targets. Mol. Biol. Evol. (2004) 21, 207-217.

17) Matsumoto, T., Takahashi, H. and Fujiwara, H. Targeted nuclear import of ORF1 protein is required for in vivo retrotransposition of telomere-specific non-long terminal repeat retrotransposon, SART1. Mol. Cell Biol. (2004) 24, 105-122.

18) Osanai, M., Takahashi, H., Kojima, K. K., Hamada, M. and Fujiwara, H.: Novel motifs in 3’-untranslated region required for precise reverse transcription start of telomere specific LINE, SART1. Mol. Cell Biol. (2004) 24, 7902-7913.

19) Maita, N., Anzai, T., Aoyagi, H., Mizuno, H. and Fujiwara, H.: Crystal structure of the endonuclease domain encoded by the telomere-specific LINE, TRAS1. J. Biol. Chem (2004) 279, 41067-41076.

20) Anzai T., Osanai, M., Hamada, M. and Fujiwara, H.: Functional roles of read-through 28S rRNA sequence in in vivo retrotransposition of non-LTR retrotransposon, R1Bm. Nucleic Acids Res. (2005) 33, 1993-2002.

21) Kojima, K. K. and Fujiwara, H.: An extraordinary retrotransposon family encoding dual endonucleases, Genome Research, in press (2005)

22) Matsumoto, T. Hamada, M. Osanai, M. and Fujiwara, H.: Essential domains for Ribonucleoprotein complex formation required for retrotransposition of a telomere specific non-LTR retrotransposon SART1. Mol. Cell. Biol. 26, 5168-5179 (2006)

23) Ando, T., Fujiyuki, T., Kawashima, T., Morioka, M., Kubo, T. and Fujiwara, H.: In vivo gene transfer into the honeybee using a nucleopolyhedrovirus vector. Biochem. Biophys. Res. Comm. 352, 335-340 (2007)

24) Kawashima, T., Osanai, M., Futahashi, R., Kojima, T. and Fujiwara, H.: A novel target-specific gene delivery system combining baculovirus and sequence-specific LINEs. Virus Research. 127, 49-60 (2007)

25) Maita, N., Aoyagi, H, Osanai, M., Shirakawa, M. and Fujiwara, H.: Characterization of the sequence specificity of the R1Bm endonuclease domain by structural and biochemical studies. Nucleic Acids Research, 35, 3918-3927 (2007)

26) Osanai-Futahashi, M. and Fujiwara, H.: Coevolution of telomeric repeats and telomeric-repeat-specific non-LTR retrotransposons in insects. Molecular Biology and Evolution. 28, 2983-2986 (2011)

27) Fujiwara, H.: Site-specific non-LTR retrotransposons. Chapter 50 in “Mobile DNA III” eds. by N. Craig et al., pp1147-1163. doi: 10.1128/9781555819217 (2015)

28) Fujiwara, H.: Site-specific non-LTR retrotransposons. Microbiology Spectrum, 3(2). April doi: 10.1128/microbiolspec.MDNA3-0001-2014 (2015)

29) Nichuguti Narisu, Hayase M. and Fujiwara, H.: Both exact target site sequence and long poly(A) tail are required for precise insertion of the 18S rDNA-specific non-long terminal repeat retrotransposon R7Ag. Mol. Cell. Biol36, 1494-1508. (2016)

1）藤原晴彦、岡崎聡（1994）染色体末端=テロメアの形成に関わるRNA. 遺伝48,　57-61.

2）藤原晴彦（1995）カイコのリボソームRNAとその遺伝子の構造と進化. 日本蚕糸学雑誌64,　401-409.

3）小島健司、藤原晴彦（2004）テロメア維持機構．放射線生物研究39，39－50．

4）藤原晴彦（2004）テロメア特異的ＬＩＮＥの転移メカニズムと適応戦略．蛋白質核酸酵素 49, 2090-2096.

5）藤原晴彦（2004）昆虫の不思議１染色体の端に共生するもの－昆虫の特異なテロメア構造．現代化学 399、41-46.

6）藤原晴彦（2004）奇妙なカイコの染色体．ニュースレター“おかいこさま”No2. 2-3.

7）藤原晴彦（2004）染色体の端に共生する因子．東京大大学院新領域創成科学研究科広報誌Frontier Sciences 創成Vol4、8．

8）藤原晴彦（2010）カイコ及び昆虫のテロメアの構造と進化、蚕糸・昆虫バイオテックVol 79, 3-11 (2010)

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