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研究の内容

2.テロメアを標的とするメカニズムとその進化的背景

(研究の背景と概要)

真核細胞の染色体末端(テロメア)の多くは数塩基対(TTAGGGなど)の反復配列で構成され、逆転写酵素様活性をもつ特殊な酵素テロメラーゼによって合成されます。テロメア領域の消失は染色体自身の不安定化をもたらすことから、テロメアが細胞の増殖や制御に重要な役割を果たしていると考えられています。一方、ヒトなどの体細胞では老化とともにテロメアが短くなり、さらに悪性の腫瘍細胞では正常な体細胞では発現していないテロメラーゼ活性が再発現することが多いと指摘されています。そこで、テロメラーゼ活性がガン診断やガン治療の重要な手がかりになると考えられる一方、老化やガン化のメカニズムとの関連を想定し、テロメア領域の構造と機能が十数年前から注目されてきました。

私たちは、昆虫のテロメア反復配列を15年ほど前から探索を始めました。その結果、カイコにおいては(TTAGG)という5塩基(ヒトなどではTTAGGG6塩基)の反復配列が染色体末端にある一方、奇妙なことにショウジョウバエなど多くの昆虫がこのテロメア反復配列を喪失していることに気づきました。欧米のグループによりショウジョウバエでは、特殊なnon-LTR型レトロトランスポゾン(HeT-ATART)が染色体の末端を認識して自らの逆転写酵素により転移することによりテロメラーゼの機能を代替していることがわかりました。昆虫の系統樹の中でテロメア反復配列の分布を見てみると、テロメラーゼ機能は何度も消失していることがわかります。ショウジョウバエではテロメラーゼ遺伝子(TERT)がゲノム上から完全に失われています。何故、昆虫ではたびたびテロメラーゼ活性が失われているのでしょうか?私たちは、現在いくつかの昆虫のテロメラーゼ遺伝子の構造を追跡してその原因を探っています。(参考文献)Okazaki et al. (1993), Fujiwara et al. (2005), Osanai et al. (2006), Mitchell et al. (2010), Osanai-Futahashi et al. (2011), Fujiwara (2015).

私たちは、カイコの染色体末端に(TTAGG)nテロメア反復配列が存在する一方、その中に異なるnon-LTR型のレトロポゾンが多数入り込んでいることを見いだしました。これらの特殊なレトロトランスポゾンは染色体への挿入方向から、TRAS, SARTと分類され、全部で1000コピー以上がテロメア領域に存在しています。ショウジョウバエのテロメア特異的レトロトランスポゾンと異なり、TRASSARTTTAGGという塩基配列を厳密に認識して転移する「部位特異的レトロトランスポゾン」であることが判明しました。カイコでは不思議なことにテロメラーゼ活性を高感度に検出するTRAP法(Telomeric repeat amplification protocol)を用いても、テロメラーゼ活性を検出することができません。現時点では、カイコの一群のテロメア特異的レトロトランスポゾンの機能は明確ではありませんが、テロメア反復配列を特異的に認識し、染色体末端の消失や減少を自らの犠牲的転移によって救済する可能性があります。(参考文献)Okazaki et al. (1995), Takahashi et al. (1997), Sasaki & Fujiwara (2000), Kubo et al. (2001), Osanai-Futahashi & Fujiwara (2011), Fujiwara (2015).

 

このような昆虫の特殊なテロメア構造とそれを標的としたレトロポゾンの挙動を知ることにより、テロメアのより一般的な機能が明確になると期待されます。さらに、これらのレトロトランスポゾンが特異的にテロメア反復配列を切断し、転移してテロメア領域を伸長する活性を利用できれば、細胞の老化やガン化に際して生じるテロメアの減少や増加を制御できる可能性があり、応用的な側面の研究も進めています。

現在研究室で行っている、具体的な研究例を挙げると

(A) テロメアを特異的に切断する酵素の構造と機能の利用:カイコのテロメア特異的LINEであるTRASSARTがテロメアを標的に転移することを最終的に決定しているのは、ORF2タンパク質のN末端領域に存在するエンドヌクレアーゼドメイン(EN)であることが明らかになりました(1.転移機構の解明参照)。そこで、ENの中のどのような機能構造がテロメア反復配列を特異的に認識しているのかを分子生物学的・構造生物学的に解析しています。ヒトのL1のようなランダムに転移するLINEのエンドヌクレアーゼと異なる構造(ベータヘアピンなど)が配列特異性に関与していると予想されます(下図参照)。現在、さらに他の配列特異的LINEのエンドヌクレアーゼの機能と構造を解析し、配列特異的切断の分子的背景を探っています。一方、TRASのENはカイコのみならず、ヒトのテロメア反復配列(TTAGGG)も特異的に切断します。テロメラーゼ活性の遮断により腫瘍活性を抑制する試みが報告されていますが、TRASENやその機能を高めたエンドヌクレアーゼを腫瘍細胞などに導入することにより、短期間にテロメア短縮を起こさせ、細胞活性や腫瘍活性にどのような影響を及ぼすか、などを調べています。これとは逆に、ヒト細胞のテロメアを標的にLINEを転移させてテロメアを伸長させることはできないか、その場合の細胞老化への影響などについて解析を進めたいと考えています。

(参考文献)Takahashi & Fujiwara (2002), Anzai et al. (2001), Maita et al. (2004), Yoshitake & Fujiwara (2010).

TRAS1ENの立体構造。Maita et al (2004) J. Biol. Chem. より

(B)部位特異的LINE、レトロエレメント、テロメラーゼの進化:ほとんどのLINEはゲノム上のあらゆる場所に転移しますが、一部のLINEはゲノム上の特定の配列にしか転移をしません。何故そのようなLINEが出現したのでしょうか?例えば、ヒトのL1は様々な場所に転移して遺伝病を引き起こすなど、自らのコピーの拡大だけを優先させると宿主の存在を脅かすことになります。そこで特定の場所にのみ転移するという戦略を持ったLINEが出現したと思われます。このようなLINEはコピー数を拡大できないではないか?実際にこのようなLINEを全ゲノムデータベースから検索すると、部位特異的LINErDNA、テロメア、マイクロサテライトといった反復的配列を標的にしており、問題を解決していることがわかりました。部位特異的LINEの進化、驚くほど古いLINEの起源、などLINEの進化に関わる研究も行っています。さらに昆虫のテロメラーゼが進化的に何度も失われるといった奇妙な現象の背景を探るために、いくつかの昆虫のテロメラーゼ遺伝子の構造・機能解析を進めています。(参考文献)Kojima & Fujiwara (2003) (2004) (2005), Kubo et al. (2002), Osanai et al. (2006), Osanai-Futahashi & Fujiwara (2011), Fujiwara (2015), Kojima et al. (2016). 

(参考文献・総説一覧) 上記研究に特に関係の深いものは黄色で示した

1)         Fujiwara, H., Ogura, T., Takada, N., Miyajima, N., Ishikawa, H. and Maekawa, H.: Introns and their flanking sequences of Bombyx mori rDNA. Nucleic Acids Res. (1984) 12, 6861-6869.

2)         Fujiwara, H., Ninaki, O., Kobayashi, M., Kusuda, J. and Maekawa, H.: Chromosomal fragment responsible for genetic mosaicism in larval body marking of the silkworm, Bombyx mori. Genet. Res. (1991) 57, 11-16.

3)         Okazaki, S., Tsuchida, K., Maekawa, H., Ishikawa, H. and Fujiwara, H.: Identification of a pentanucleotide telomeric sequence, (TTAGG)n, in the silkworm, Bombyx mori and in other insects. Mol. Cell. Biol. (1993) 13, 1424-1432.

4)         Fujiwara, H., Yanagawa, M. and Ishikawa, H.: Mosaic formation by developmental loss of chromosomal fragment in a genetic mosaic, mottled striped of the silkworm, Bombyx mori. Roux's Arch. Dev. Biol. (1994) 203, 389-396.

5)         Fujiwara, H. and Maekawa, H.: RFLP analysis of chromosomal fragments in mottled striped strains of the silkworm, Bombyx mori. Chromosoma (1994) 103, 468-474.

6)         Okazaki, S., Ishikawa, H. and Fujiwara, H: Structural analysis of TRAS1, a novel family of telomeric repeat associated retrotransposons in the silkworm, Bombyx mori. Mol. Cell. Biol. (1995) 15, 4545-4552.

7)         Takahashi, H., Okazaki, S. and Fujiwara, H.: A new family of site-specific retrotransposons, SART1, is inserted into telomeric repeats of the silkworm, Bombyx mori.. Nucleic Acids Res. (1997) 25, 1578-1584.

8)         Takahashi, H. and Fujiwara, H.: Transcription analysis of the telomeric repeat-specific retrotransposons TRAS1 and SART1 of the silkworm Bombyx mori. Nucleic Acids Res. (1999) 27, 2015-2021.

9)         Sasaki, T. and Fujiwara, H.: Detection and distribution patterns of telomerase activity in insects. Eur. J. Biochem. (2000) 267, 3025-3031.

10)     Fujiwara, H., Nakazato, Y., Okazaki, S. and Ninaki, O.: Stability and telomere structure of chromosomal fragments in two different mosaic strains of the silkworm, Bombyx mori. Zool Sci. (2000) 17, 743-750.

11)     Anzai, T., Takahashi, H. and Fujiwara, H.: Sequence-specific recognition and cleavage of telomeric repeat (TTAGG)n by endonuclease of non-LTR retrotransposon, TRAS1. Mol Cell. Biol. (2001) 21, 100-108.

12)     Kubo, Y., Okazaki, S., Anzai, T. and Fujiwara, H.: Structural and phylogenetic analysis of TRAS, telomeric repeat-specific non-LTR retrotransposon families in lepidopteran insects. Mol. Biol. Evol, (2001) 18. 848-857.

13)     Kojima, K, Kubo, Y. and Fujiwara, H.: Complex and tandem repeat structure in sub-telomere of crickets, T. taiwanemma. J. Mol. Evol, (2002) 54, 474-485.

14)     Takahashi, H. and Fujiwara, H.: Transplantation of target site specificity by swapping endonuclease domains of two LINEs. EMBO. J. (2002) 21, 408-417.

15)     Kojima, K. K. and Fujiwara, H.: Evolution of target specificity in R1 clade non-LTR retrotransposons. Mol. Biol. Evol, (2003) 20, 351-361.

16)     Kojima, K. K. and Fujiwara, H.: Cross-genome screening of novel sequence-specific non-LTR retrotransposons: various multicopy RNA genes and microsatellites are selected as targets. Mol. Biol. Evol. (2004) 21, 207-217.

17)     Matsumoto, T., Takahashi, H. and Fujiwara, H. Targeted nuclear import of ORF1 protein is required for in vivo retrotransposition of telomere-specific non-long terminal repeat retrotransposon, SART1. Mol. Cell Biol. (2004) 24, 105-122.

18)     Osanai, M., Takahashi, H., Kojima, K. K., Hamada, M. and Fujiwara, H.: Novel motifs in 3’-untranslated region required for precise reverse transcription start of telomere specific LINE, SART1. Mol. Cell Biol. (2004) 24, 7902-7913.

19)     Maita, N., Anzai, T., Aoyagi, H., Mizuno, H. and Fujiwara, H.: Crystal structure of the endonuclease domain encoded by the telomere-specific LINE, TRAS1. J. Biol. Chem (2004) 279, 41067-41076.

20)     Anzai T., Osanai, M., Hamada, M. and Fujiwara, H.: Functional roles of read-through 28S rRNA sequence in in vivo retrotransposition of non-LTR retrotransposon, R1Bm. Nucleic Acids Res. (2005) 33, 1993-2002.

21)     Fujiwara, H., Osanai, M., Matsumoto, T. and Kojima, K. K.: (Review article) Telomere-specific non-LTR retrotransposons and telomere maintenance in the silkworm, Bombyx mori” Chromosome Research 13, 455-467 (2005).

22)     Kojima, K. K. and Fujiwara, H.: An extraordinary retrotransposon family encoding dual endonucleases, Genome Research, in press (2005).

23)     Kojima, K. K. Matsumoto, T. and Fujiwara, H.: Eukaryotic translation coupling in UAAUG stop-start codons for the bicystronic RNA translation of non-LTR retrotransposon SART1. Mol. Cell Biol 25, 7675-7686. (2005)

24)     Kojima, K. K. and Fujiwara, H.: Long-term inheritance of the 28S rDNA-specific retrotransposon R2, Mol. Biol. Evol. 22, 2157-2165 (2005)

25)     Matsumoto, T. Hamada, M. Osanai, M. and Fujiwara, H.: Essential domains for Ribonucleoprotein complex formation required for retrotransposition of a telomere specific non-LTR retrotransposon SART1. Mol. Cell. Biol. 26, 5168-5179 (2006)

26)     Osanai, M., Kojima, K. K., Futahashi, R., Yaguchi, S. and Fujiwara, H.: Identification and characterization of the telomerase reverse transcriptase of Bombyx mori (silkworm) and Tribolium castaneum (flour beetle). Gene 376, 281-289 (2006)

27)     Kojima KK. Kuma, K., Toh, H. and Fujiwara, H.: Identification of rDNA-specific non-LTR retrotransposons in Cnidaria. Molecular Biology and Evolution, 23, 1984−1994 (2006)

28)     Osanai-Futahashi, M., Suetsugu, Y., Mita, K. and Fujiwara, H.: Genome-wide screening and characterization of transposable elements and their distribution analysis in the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochem. Mol. Biol. 38, 1046-1146 (2008)

29)     Yoshitake, K., Aoyagi, H. and Fujiwara, H.: Creation of a novel telomere-cutting endonuclease based on the EN domain of telomere-specific non-LTR retrotransposon, TRAS1. Mobile DNA, 1, 13 (open access) (2010)

30)     Mitchell, M., Gillis, A., Futahashi, M., Fujiwara, H. and Skordalakes, E.: Structural basis for telomerase catalytic subunit TERT binding to RNA template and telomeric DNA. Nature Structural and Molecular Biology, 17: 513-518 (2010)

31)     Osanai-Futahashi, M. and Fujiwara, H.: Coevolution of telomeric repeats and telomeric-repeat-specific non-LTR retrotransposons in insects. Molecular Biology and Evolution. 28, 2983-2986 (2011)

32)     Fujiwara, H.: Accumulation of Telomeric-Repeat-Specific Retrotransposons in Subtelomere of Bombyx mori and Tribolium castaneum. Capter 13 in “Subtelomeres” eds. by E. J. Louis & M. M. Becker, 227-241, Springer (2014)

33)     Fujiwara, H.: Site-specific non-LTR retrotransposons. Chapter 50 in “Mobile DNA III” eds. by N. Craig et al., pp1147-1163. doi: 10.1128/9781555819217 (2015) 2015.8/25

34)     Fujiwara, H.: Site-specific non-LTR retrotransposons. Microbiology Spectrum, 3(2). April doi: 10.1128/microbiolspec.MDNA3-0001-2014 (2015)

35)     Kojima, K. Seto, Y., Fujiwara, H.: The wide distribution and change of target specificity of R2 non-LTR retrotransposons in animals. PLoS One, e0163496 (2016)

 

1)   藤原晴彦、岡崎聡(1994)染色体末端=テロメアの形成に関わるRNA. 遺伝48, 57-61.

2)   藤原晴彦(1995)カイコのリボソームRNAとその遺伝子の構造と進化. 日本蚕糸学雑誌64, 401-409.

3)   小島健司、藤原晴彦(2004)テロメア維持機構.放射線生物研究393950

4)   藤原晴彦(2004)テロメア特異的LINEの転移メカニズムと適応戦略.蛋白質核酸酵素 49, 2090-2096.

5)   藤原晴彦(2004)昆虫の不思議1染色体の端に共生するもの−昆虫の特異なテロメア構造.現代化学 39941-46.

6)   藤原晴彦(2004)奇妙なカイコの染色体.ニュースレター“おかいこさま”No2. 2-3.

7)   藤原晴彦(2004)染色体の端に共生する因子.東京大大学院新領域創成科学研究科広報誌Frontier Sciences 創成Vol48

8)   藤原晴彦(2007)染色体の端を守る“動く遺伝子”、日経サイエンス、37、64−73.

9)   藤原晴彦(2009)染色体の端を守る“動く遺伝子”、日経サイエンス特集号「生命の起源」、168、134−142.

10)   藤原晴彦(監訳)、遠藤圭子(訳)(2010)せめぎあう遺伝子(Austin Burt & Robert Trivers著) 645ページ、共立出版

11)   藤原晴彦(2010)カイコ及び昆虫のテロメアの構造と進化、蚕糸・昆虫バイオテック Vol 79,3-11 (2010)

 


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